小技巧之Western Blot中如何消除内源的小技过氧化物酶

Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶？

本篇为转载，原作者为中国海洋大学的何消化物孙同学；转载链接为 <https://www.ebiotrade.com/newsf/2010-4/2010427165748399.htm>

Figure 1. Details of the steps involved in obtaining protein for western blot.

Figure 2. Figure detailing the steps in conducting a western blot.

项目：Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶

背景：在Western Blot的显色中，常用的除内标记酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。其中HRP因特异性强、过氧分子量小、小技稳定且作用底物范围广等优点而得到广泛使用。何消化物然而，除内某些细胞中存在大量线粒体，过氧内源的小技过氧化物酶浓度自然比较高，它们可能会造成膜上出现一些“假的何消化物”条带。

方法改进：为了避免内源过氧化物酶对实验结果的除内影响，我们采用下列步骤来消除它。过氧将制备好的小技胃壁细胞裂解液与上样缓冲液混合，上样到SDS-PAGE胶上。何消化物电泳之后，除内转膜。转膜之后，立即将膜放置在3% H2O2中，孵育15分钟。孵育之后，用TBS（25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）洗涤，之后用5%脱脂奶粉封闭。接着按照常规步骤进行下去。

结果：未用H2O2孵育之前，我们在膜上发现了一条约30 kDa的非特异条带。即使在不加一抗或二抗的情况下，依然在膜上显色，说明内源过氧化物酶存在。经过H2O2的孵育，这条带消失了。这种方法适用于线粒体较多的细胞（如肝细胞或中性粒细胞），能够让Western Blot的结果更加特异。

(责任编辑：综合)